Este fue el primer villano al que tuvo que enfrentar el Hombre Araña. Dmitri Smerdyakov es un espía internacional, al principio con un equipo acústico de disfraces, ahora con un cinturón capaz de copiar cualquier imagen y proyectar un holograma tridimensional de esta. El Camaleón fue el responsable de la "reaparición" de los padres de Peter Parker y con esto ocasionó un gran dolor en la vida del Hombre Araña.

Adrián Toomes era un empresario obsesionado con el dinero y el poder. Creó un par de alas mecánicas para vengarse de un traidor, pero, en un intento de ganar más velocidad y fuerza, la energía de las alas ocasionó que a Adrián le diera cáncer. Con su enfermedad y su vejez, Adrián no tenía esperanzas de vida, hasta que absorbió la energía del clon de la madre de Peter Parker que había hecho el Camaleón. Con esta energía, Adrián se curó y se volvió más joven y ahora, con una nueva armadura de buitre capaz de absorber energía, ha vuelto a sus fechorías. El Buitre recientemente contagió al Hombre Araña con un virus mortal que casi lo mata.

El Dr. Otto Octavius creó unos brazos mecánicos que le ayudaban en sus experimentos con radiación. En una explosión estos brazos fueron fusionados a la espina dorsal de Otto y adquirió control mental sobre ellos. Con el fin de conseguir dinero para sus experimentos, el Dr. Pulpo se dedicó a la carrera del crimen y fue líder del grupo de super villanos conocido como los "Seis Siniestros". Recientemente cambió sus tentáculos por unos del metal indestructible Adamantio. Cuando el Buitre contagió al Hombre Araña con su virus mortal, el Dr. Pulpo lo salvó, para después morir a manos de Kain.

El Dr. Curt Connors había perdido una mano y estaba experimentando con la habilidad de los reptiles de reemplazar sus miembros cuando un descuido hizo que la estructura molecular del Dr. Connors se fusionara con la de un reptil, convirtiéndolo en un lagarto gigante. Como el Lagarto fue usado por la bruja vudú Calypso como máquina asesina para vengarse del Hombre Araña por haber matado a Kraven, el Cazador, pero recientemente fue curado. Poco después se separó la maldad del Lagarto de Connors, pero recientemente ha vuelto. Aunque el Dr. Connors ha ayudado muchas veces al Hombre Araña, el Lagarto es uno de sus enemigos más viejos.

El electricista Maxwell Dillon estaba componiendo unos cables cuando un rayo le cayó. En lugar de matarlo, el rayo le dio la habilidad de controlar todo tipo de electricidad. Siguiendo el camino fácil, Maxwell tomó el nombre de Electro y se ha dedicado al crimen desde entonces. Esto lo ha puesto siempre en contra del Hombre Araña.

El especialista Quentin Beck tomó el camino del mal y pasó de ser el mejor creador de efectos especiales de Hollywood a ser Mysterio, el maestro de la ilusión. Usando sus ilusiones, Mysterio comenzó a cometer crímenes usando efectos especiales del cine, pero ahora utiliza desde hologramas tridimensionales hasta su propia "neblina de ilusión" para crear sus ilusiones. Pero a pesar de todas sus ilusiones, no ha podido escapar del Hombre Araña.

El disfraz del Duende Verde ha sido utilizado por varias personas. Primero fue Norman Osborn, padre de Harry, el mejor amigo de Peter Parker en la escuela. Norman creó todo un equipo y su traje con el fin de enfrentar al Hombre Araña. El Duende Verde descubrió la identidad del Hombre Araña y lo amenazaba con descubrirla al mundo. Aunque estuvo curado por unos días, norman volvió a convertirse en el Duende Verde, descubrió una fórmula para incrementar su fuerza y asesinó a la novia de Peter Parker, Gwen Stacy, para después morir por culpa de su propio artefacto volador. Su hijo Harry Osborn vio la muerte de su padre y adoptó el traje del Duende Verde para vengarse de su "amigo" Peter. El Hombre Araña lo venció fácilmente y lo llevó a que lo atendiera el psicólogo Hamilton, quien se obsesionó con el Duende Verde, descubrió un escondite del original y adoptó también su identidad. También fue derrotado por el Hombre Araña, pero Harry encontró la fórmula secreta de su padre para incrementar la fuerza y volvió a adoptar el traje del Duende Verde. Harry también amenazó al Hombre Araña con revelar su identidad secreta, pero Peter Parker aún lo consideraba su amigo y no podía dejarlo solamente encerrado sin tratamiento. Al final, la fórmula para incrementar la fuerza de norman Osborn poco a poco fue acabando con Harry hasta que murió, salvando a su amigo Peter de una explosión que él mismo había planeado. Recientemente Phillip Urich apareció como un nuevo Duende Verde, aunque parece que este nuevo duende tiene fines más nobles.

Kraven (El Cazador) 

Sergei Kravinov era un experto en cacería y no existía presa que pudiera escapar de él. Buscando un mayor reto, Kraven decidió cazar al animal más peligroso: el ser humano. Así, Kraven intentó cazar al Hombre Araña, pero este fue demasiado para él. Sin darse por vencido, Kraven desarrolló una fórmula que le aumentaba su fuerza y sentidos para la cacería. Ahora Kraven se volvió un verdadero reto para el Hombre Araña, incluso logró enterrarlo vivo. Este último acto hizo que el Hombre Araña se desesperara y, cuando buscó a Kraven, este último se había suicidado con una escopeta, quitándole así la venganza.

El Escorpión nació como un proyecto financiado por el editor del Clarín J. Jhonas Jameson para convertir a un voluntario en un arma para acabar con el Hombre Araña. Expuesto a la radiación del DNA de un escorpión y con un traje equipado con una cola mecánica que funciona igual que la cola de un escorpión, MacDonald Gargan se volvió un enemigo "natural" del Hombre Araña. Con los años se había vuelto más inestable y peligroso; pero, parece ser que, ahora se ha calmado.

En un intento de crear super seres, Rhino fue escogido, expuesto a radiación y capturado en una armadura virtualmente indestructible de rinoceronte. La vida de Rhino ha sido la de un ladrón y mercenario y la mayoría de sus trabajos lo han puesto contra el Hombre Araña a lo largo de los años.

Todas las operaciones de la mafia de Nueva York son organizadas y administradas por un sólo hombre, el Kingpin. Su entrenamiento en judo ha hecho que Wilson Fisk desarrolle un músculo en su abdomen que normalmente se confunde con obesidad. El Hombre Araña y otros vigilantes como Daredevil y Punisher estorban en su camino por lo que a pesar de no contar con super poderes, siempre ha sido un enemigo difícil de vencer. Kingpin destruyó la vida privada de Daredevil, pero después todo su imperio fue derrocado por éste héroe y su hijo Richard Fisk intentó tomar su lugar.

El traje del Nuevo Duende ha sido usado por varias personas. Ned Leeds encontró un escondite del Duende Verde y con unas modificaciones se convirtió un el Nuevo Duende, quien junto con Richard Fisk intentó dañar al Rey del Crimen varios años atrás. Leeds se hizo de enemigos y el mercenario Jason Phill Macendale lo mató y adoptó el disfraz del Nuevo Duende. El armamento del Nuevo Duende era suficiente, pero la ambición de Macendale le hizo hacer un pacto con un demonio para conseguir más poder. El resultado, un Nuevo Duende con un aspecto más demoniaco. Recientemente, Macendale se separó del demonio que lo habitaba, pero aun es el mejor en lo que hace... y lo que mejor hace es matar por una gran suma de dinero.

Thomas Fireheart es un empresario importante hasta que la bruja vudú Calypso lo convirtió en Puma, dios indio de la montaña. Como Puma, Fireheart pierde totalmente la razón y mata a placer. Por si esto fuera poco, Puma es otra de las pocas personas que sabían de la identidad secreta del Hombre Araña hasta que el Cuervo Negro los puso a Puma y al Hombre Araña a prueba y, como recompensa al valor del Hombre Araña, el Cuervo Negro lo hizo olvidar a Puma la identidad secreta del Hombre Araña. Puma sigue vivo y asechando entre las sombras la vida del Hombre Araña.

Cuando el Hombre Araña volvió de las Guerras Secretas, regresó con un nuevo traje negro. Este traje incrementaba su fuerza arácnida y podía imitar cualquier tipo de ropa o material. Poco después, Peter Parker se enteró que su traje estaba vivo y que era un organismo alienígena simbiótico que quería ser parte de él. Peter se dio cuenta que el traje era vulnerable al fuego y al sonido. Con las campanas de una iglesia, el Hombre Araña se deshizo del ser simbiótico. Por otro lado Edward Brock era reportero del diario El Globo, pero el Hombre Araña desmintió una de sus historias y quedó despedido. Eddie fue a la iglesia a quitarse la vida, pero se encontró con el alien simbiótico y se unió a él para formar al peor enemigo del Hombre Araña: Venom. Como ahora son una sola unidad, Venom tiene la habilidad de no hacer "vibrar" el sentido arácnido del Hombre Araña y se considera a él mismo como un "protector letal" ya que aun protege al inocente, pero mataría para poder llegar al Hombre Araña y tomar venganza de haberle quitado su inocencia.

Cletus Kasady era el compañero de celda de Eddie Brock. Cuando el traje alienígena de Venom lo rescató de la prisión, dejó un residuo que se metió al flujo sanguíneo de Cletus por una herida que tenía, así nació el "hijo" de Venom, Carnage. A diferencia de Venom, Carnage mata sin orden ni razón a quien se le ponga en frente. La locura de Carnage hizo que el Hombre Araña se aliara con Venom para detenerlo. Aunque lo detuvieron, Carnage escapó de nuevo y se unió a Aullido para matar a todo Nueva York. Venom volvió a aliarse con el Hombre Araña para venecerlo, pero como el alien simbiótico está en la sangre de Cletus, Carnage no puede morir. Al igual que Venom, Carnage no alerta el sentido arácnido del Hombre Araña.

Durante la Guerra del Infinito, Magus creó dobles siniestros de los Super Héroes del Universo Marvel y el Demonio Araña es el doble del Hombre Araña. Se supone que al finalizar la Guerra del Infinito desaparecieron todos los dobles, pero por algún extraño motivo este seguía vivo. Durante la batalla Espíritus de Venom, le ayudó al Demoduende para intentar capturar al Nuevo Duende. Cuando Carnage y Aullido escaparon del Instituto Ravencoft lo encontraron y adoptaron como su hijo, pero después Carnage lo mató.

El pasado de Aullido es bastante confuso. Al parecer Frances fue una niña golpeada y abusaron sus padres de ella. Se volvió una drogadicta que se enfrentó a la dimensión de la oscuridad de Capa pero sobrevivió y ahora con sus poderes sónicos desarrollados estaba encerrada en Ravnecoft hasta que Carnage la liberó y desataron la locura en Nueva York. Cuando estuvo capturada escapó y enfrentó al Hombre Araña otra vez. Para salvar a Carroña (otro de sus "hijos"), absorbió el virus Carroña a su cuerpo, el mismo que después el Chacal le quitaría.

Se conoce poco sobre el pasado de Judas Traveller. Llego a Ravnecoft diciendo ser un doctor que iba a analizar a los internados. Así fue, pero sacó del Instituto a todos los trabajadores y sólo quedaron él y sus ayudantes. Al ver que la mayoría eran enemigos del Hombre Araña, lo mandó llamar con la propuesta de que, si no asistía mataría a los enfermos y si él ganaba, dejaría a todos los enfermos libres. El Hombre Araña no pudo derrotar sólo a Traveller, por lo que éste último llamó a "su clon" Ben Really para que fuera por él. Entre Peter y Ben lograron salvar a los internos de Ravencoft, pero Traveller y sus secuaces escaparon. Con grandes poderes psíquicos, Traveller es el enemigo que más ha hecho dudar al Hombre Araña de su cordura.